小麦源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒实验方法步骤

小麦源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒实验方法步骤:

方法

1:在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix (2mM)             

4 μl     引物1(10pM)                 

2 μl     引物2(10pM)                 

2 μl     Taq酶 (2U/μl)               

1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,在72℃ 保温7min。

3结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。

PCR实验步骤

典型的PCR由(1)高温变性模板;(2)引物与模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是:

将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93℃-94℃)使其变性解成单链;

人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合,两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短;

耐热的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入,以目的基因为模板从5’→3’方向延伸,合成DNA的

CSC, 小鼠心肌细胞

小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）

MEF, 小鼠胚胎成纤维细胞

MM, 小鼠小胶质细胞

mCF, 小鼠心脏成纤维细胞

MN-c, 小鼠皮质神经元

 细胞名称

人绒毛膜毛细血管内皮细胞

人羊膜上皮细胞

人绒毛间充质成纤维细胞

人羊膜间充质基质细胞

人绒毛膜间充质基质细胞

 正常细胞

NRK-52E，大鼠肾细胞

H9c2大鼠心肌细胞（ATCC来源）

C2C12, 小鼠肌原细胞

NIH/3T3, 小鼠成纤维细胞系

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）

HSC-T6, 大鼠肝星状细胞系

CHO, 中国仓鼠卵巢细胞系

COS-7L, 非洲绿猴肾成纤维细胞

SF9, 昆虫卵巢细胞

BRL 3A, 大鼠肝正常细胞

HK-2, 人肾皮质近曲小管上皮细胞

HET-1A, 人食管上皮细胞

RGC-5, 小鼠视网膜神经节细胞

GC-1, 鼠精原细胞

293A，人胚肾上皮细胞系（腺病毒包装级别）

hDPSCs, 人前磨牙牙髓干细胞

293T, SV40转化的人胚肾上皮细胞系